Окраски

Гематоксилин-эозин
Азан по Гейденгайну
Конго красный
по Гимзе
Трехцветное окрашивание
по Граму
метенамином серебра по Грокотту
по Маллори
Орсеин
ШИК-реакция
по Ван Гизону
по Циль-Нильсену

Окраска гематоксилином и эозином

Гематоксилин-эозин или (H&E, HE, ГЭ) это самый распространенный метод окраски в гистологии. Это наиболее широко используемый для медицинской диагноситки метод; например при оценке биопсий с подозрением на рак, ,гистологический срез будет окрашен гематоксилин-эозином и назван H&E-, H+E-, HE- или ГЭ-срезом.
Этот метод окрашивания включает применение основного красителя - гематоксилина, который окрашивает базофильные структуры в сине-фиолетовый цвет, , и спиртового кислого красителя эозина, который окрашивает эозинофильные структуры в ярко-розовый.
Базофильные структуры это обычно те, что содержат нуклеиновые кислоты, такие как рибосомы, богатые хроматином ядра клеток, а также участки цитоплазмы богатые РНК.
Эозинофильные структуры обычно представлены внутри- и внеклеточными белками. . Тельца Леви и Маллори являются примерами эозинофильных структур. . Цитоплазма в основном эозинофильна. Эритроциты окрашиваются в интенсивный красный цвет.
Структуры не должны быть кислыми или основными, чтобы быть названными базофильными и эозинофильными. Терминология основывается на сродстве к красителям.
Другие цвета, например желтый и коричневый, могут присутствовать в образце; они обусловлены внутренними пигментами, например меланином. .
Некоторые структуры плохо окрашиваются. Базальную пластинку, если она должна быть хорошо видна, следует окрасить с помощью ШИК-реакции или серебром. Ретикулярные волокна также требуют окраски серебром. Гидрофобные структуры также имеют тенденцию оставаться прозрачными; они, как правило, богаты жирами. Например: адипоциты, миелиновая оболочка аксонов нейронов и мембранны комплекса Гольджи

Конго красный

В биохимии и гистологии, конго красный используется для окрашивания микроскопических препаратов, особенно цитоплазмы и эритроцитов . Яблочно-зеленое двойное лучепреломление в поляризованном свете, в препаратах окрашенных Конго красным, указывает на присутствие амилоидных фибрилл. Кроме того, Конго красный используется в микробиологической эпидемиологии для быстрого выявления вирулентного серотипа 2а шигеллы Флекснера, так как краситель связывается с уникальным липополисахаридом (ЛПС) бактерии.

Азан

Окраска азаном это комплексный метод в общей гистологии. Это окраска подходит для цветных фотографий, ядер, эритроцитов, фибрина, фибриноида, ацидофильной цитоплазмы, эпителиального гиалина, и так далее, что окрашиваются "красным" азокармином G. Коллагеновые волокна, базофильная цитоплазма, слизь, и т.д. контрастно окрашиваются анилиновым синим или оранжевым G.

Окраска по Гимзе

Окраска названная в честь Густава Гимзе, исследователя малярии, используется в гистопатологической диагностике малярии и других паразитов.
Окраска является специфической для фосфатных групп ДНК и прикрепляется к тем участкам ДНК, где есть много аденин-тиминовых связей. Используется в Гимза-бэндинге (часто называемый "G-бэндинг"), для окраски хромосом и создания их идиограмм. Это позволяет определить различные хромосомные аберрации, такие как транслокации.
Метод может применяться при изучения адгезии патогенных бактерий к клеткам человека. Он дифференциально окрашивает человеческие и бактериальные клетки в фиолетовый и розовый соответственно.
Окраска может быть использована для гистопатологической диагностики малярии и некоторых других спирохет и простейших кровяных паразитов . Также используется в окраске тканей по методу Уолбаха. Гимза является классическим красителем для мазков периферической крови и образцов костного мозга. Эритроциты окрашиваются в розовый, тромбоциты- в бледно-розовый, цитоплазма лимфоцитов и моноцитов окрашивается соответственно в небесно- и бледно-голубой, а ядерный хроматин лейкоцитов становится пурпурным.
Окраска по Гимзе также используется для визуализации хромосом и окрашивает грибы Histoplasma. Краситель представляет собой смесь метиленового синего с эозином. Готовый раствор получают из коммерчески доступного порошка Гимза.
Тонкая пленка образца на предметном стекле микропрепарата фиксируется в чистом метаноле в течение 30 секунд, путём погружения или нанесения нескольких капель . Препарат погружают в свежеприготовленный 5% -ый раствор Гимза на 20-30 минут (для срочных ситуаций может быть использован 10%-й раствор на 5-10 минут), затем промывают водой и оставляют сохнуть. [3]

Трехцветные окраски

 Трёхцветную окраску по Гомори используют для мышечной ткани. Метод может быть использован для диагностики некоторых форм митохондриальной миопатии. Он назван в честь Джорджа Гомори, который разработал его в 1950 году.

 Трихромом в модификации Лилли является комбинацией используемых в гистологии красителей. Этот метод похож на трихром по Массону, но для окраски цитоплазмы используется краситель Бибрич красный.

 Трихром по Массону- это используемый в гистологии способ трехцветного окрашивания. Рецепты претерпевали изменения от оргинальной формулировки Массона в зависимости от различных целей их использования, но все они подходят для различения клеток от окружающей соединительной ткани.
Большинство рецептов приводит к получению красного кератина и мышечных волокон, синих или зелёных коллагена и костной ткани, светло-красной или розовой цитоплазы, и тёмно-коричневых или чёрных ядер.
Трихромом получается путем погружения фиксированного образца в железный гематоксилин Вейгерта, и, затем, в три разных раствора, маркируемых как А, В, и С.
Гематоксилин Вейгерта- это последовательность трёх растворов: хлорида железа в разбавленной соляной кислоте, гематоксилина в 95% этаноле и ферроцианида калия алкализированного бурой. Он используется для окраски ядер.
Раствор А, также называемый "цитоплазматическая окраска", содержит кислый фуксин, ксилидин Понсо, ледяную уксусную кислоту и дистиллированную воду. Могут быть испльзованы другие красные кислотные красители, например, Бибрич красный в модификации трихрома по Лилли.
Раствор В содержит молибдофосфорную кислоту, разбавленную дистиллированной водой.
Раствор С, также называемый "фибриновой окраской", содержит краситель "светло-зелёный SF желтоватый" или альтернативный "зелёный прочный FCF". Это используется для окраски коллагена. Если вместо зелёного предпочтителен синий цвет, то может быть использован метиленовый/анилиновый/водный синий краситель.
Варианты
Частый вариант- это модификация Лилли. Этот вариант часто ошибочно называют трихромом по Массону. Они различны в используемых красителях, их концентрации и времени выдержки. .
Другим частым вариантом явялется комбинированное использование двух окрасок: трихромом по Массону и окраски по Верхоеву. Этот метод иногда называют просто "трихромом по Массону". Эта комбинация пригодна для исследования кровеносных сосудов; окраска по Верхоеву выявляет эластин (чёрного цвета) и позволяет легко различать мелкие артерии (которые, как правило, имеют две эластические пластинки) и вены (которые имеют одну эластическую пластинку).

Окраска по Граму

Окрашивание по Граму (или метод Грама) - эмпирический метод разделения бактерий на две большие группы (Грам - положительные и Грам - отрицательные),
основанный на химических и физических свойствах их клеточной стенки.
В то время, как окрашивание по Граму является ценным диагностическим инструментом в клинических и научных исследованиях,
не все бактерии могут быть окончательно классифицированы по этой методике, т.к. образуют переменные и неопределенные группы.
Метод назван в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853 - 1938),
который разработал эту технику в 1884 году для того, чтобы различить два типа бактерий с аналогичными клиническими симптомами: Streptococcus pneumoniae
(также известный как пневмококк) и Klebsiella pneumoniae.
Слово "Грам" всегда пишется с большой буквы, ссылаясь на имя изобретателя окрашивания по Граму.

Использование

Окрашивание по Граму используется для разделения образцов бактерий на две большие группы (грамположительных и грамотрицательных) на основе физических свойств их клеточных стенок.
Окрашивание по Граму не используется для классификации домена Археи, так как эти микроорганизмы дают весьма разнообразные результаты, которые не соотвествуют их филогенетическим группам.

Исследования

Окрашивание по Граму это бактериологический лабораторный метод.
Метод используется в качестве инструмента для дифференциации грамположительных и грамотрицательных бактерий,
в качестве первого шага для определения идентичности конкретного бактериального образца.
Однако, окрашивание по Граму не является непогрешимым инструментом для диагностики, идентификации или определения филогенеза.
Метод чрезвычайно ограниченно используется в микробиологии окружающей среды и в значительной степени заменен молекулярными методами, даже в медицинских микробиологических лабораториях.
Некоторые микроорганизмы грамвариабельные (это означает, что они могут окрашиваться как положительно, так и отрицательно); некоторые микроорганизмы не восприимчивы любым красителям, используемых в методе Грама.
В современных биологических или медицинских микробиологических лабораториях, большая часть идентификаций осуществляется с помощью метода генетических последовательностей и других молекулярных методов,
которые являются гораздо более специфичными и информационно-богатыми, чем методы дифференциального окрашивания.

Медицина

Окраске по Граму подвергаются биожидкости либо биоптаты, когда есть подозрение на инфекцию.
Результаты могут быть получены гораздо быстрее, чем при испльзовании культурального метода, что особенно важно, когда наличие или отсутвие инфекции изменяет прогноз и лечебную тактику для пациента ,
например, спинномозговая жидкость при менингите и синовиальная жидкость при септическом артрите.
Идентифицикация бактерий по положительному или отрицательному результату окраски, фотографии, данных истории болезни- это типичные вопросы на медицинских экзаменах.
Специальные окраски (такие как тушь для Cryptococcus) или характерный рост на питательной среде (для гемолитического стрептококка) также встречаются в виде тестовых вопросов.
 
Механизм окраски

Грамположительные бактерии имеют толстую сетчатого вида клеточную стенку, состоящую из пептидогликана (50-90% клеточной стенки),
который окрашивается в фиолетовый цвет, в то время как грамотрицательные бактерии имеют тонкий слой (10% клеточной стенки), который окрашивается в розовый цвет.
Грамотрицательные бактерии также имеют дополнительную внешнюю мембрану, которая содержит липиды и отделена от клеточной стенки периплазматическим пространством.
Существуют четыре основных этапа окраски по Граму, которые включают применение первичного окрашивания (кристаллическим фиолетовым) к фиксированному нагреванием мазку бактериальной культуры,
с последующим добавлением улавливающего вещества (йода по Граму), быстрого обесцвечивания спиртом или ацетоном, и контрастным окрашиванием с сафранином или основным фуксином.
Кристаллический фиолетовый (CV) диссоциирует в водных растворах в ионы CV + и Cl –.
Эти ионы проникают через клеточную стенку и клеточную мембрану грамположительных и грамотрицательных клеток.
CV + ион взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами бактерий и окрашивает их в фиолетовый цвет.
Йод (I - или I3 -) взаимодействует с CV + и образует большие комплексы кристаллического фиолетового и йода (CV-I) в пределах внутренних и внешних слоев клетки.
Йод часто упоминается как протрава, но это улавливающий агент, который предотвращает удаление комплексов CV-I и, следовательно определяет цвет бактерии.
Когда добавляются обесцвечивающие вещества, такие как спирт или ацетон, они взаимодействует с липидами клеточной мембраны.
Грамотрицательные клетки потеряют свою внешнюю мембрану и липополисахаридный слой станет открыт.
Комплексы CV-I смываются от грамотрицательных бактерий вместе с наружной мембраной. В противоположность этому, грамположительные бактерии становятся обезвоженными после обработки спиртом.
Большие CV-I комплексы остаются захваченными внутри грамположительных бакетрий из-за слоистого строения их пептидогликана.
Этап обесцвечивания является критическим и должен быть выполнен в строгом временном промежутке;
кристаллический фиолетовый краситель будет удален как из грамположительных так из грамотрицательных бактерий, если обесцвечивающий агент будет оставлен слишком долго (в течение секунд).
После обесцвечивания, грамм-позитивные бактерии остаются фиолетовыми, а грамотрицательные фиолетовую окраску теряют.
Контрастное окрашивание, для которого, как правило, используется положительно заряженный сафранин или основной фуксин, проводится в последнюю очередь, чтобы окрасить обесцвеченные грамотрицательные бактерии в розовый или красный цвет. Контрастное окрашивание, для которого, как правило, используется положительно заряженный сафранин или основной фуксин, проводится в последнюю очередь, чтобы окрасить обесцвеченные грамотрицательные бактерии в розовый или красный цвет.
Некоторые бактерии, после окрашивания по Граму, получают грамвариабельный паттерн: у них наблюдаются сочетание розового и фиолетового цветов.
Роды Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium и Propionibacterium имеют клеточные стенки, особенно чувствительные к поломке во время клеточного деления,
в результате чего происходит грамотрицательное окрашивание этих грамположительных бактерий.
В культурах Bacillus, Butyrivibrio и Clostridium уменьшение толщины пептидогликана
в процессе роста совпадает с увеличением числа клеток, что окрашиваются как грамотрицательные.

Кроме того, для всех бактерий имеет значение возраст культуры, который может повлиять на результаты окрашивания по Граму.
.
Примеры

  - Грамотрицательные бактерии

Протеобактерии составляют основную группу грамотрицательных бактерий.
Другие значительные группы грамотрицательных бактерий включают цианобактерии, спирохеты, зелёные серобактерии и зелёные не-серные бактерии.
Они также включают в себя многие медицински релевантные грамотрицательные кокки, бациллы и многие другие бактерии, связанные с внутрибольничными инфекциями.

 - Грамположительные бактерии

В оригинальной бактериальной таксономической категории, грамположительные формы составляют тип Firmicutes, это имя в настоящее время используется для большой группы бактерий.
Она включает в себя многие известные роды, например, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Diplococcus pneumoniae и Clostridium.
Это группа также была расширена, чтобы включить Mollicutes (Микоплазмы), бактерии, которые лишены клеточной стенки, и поэтому не могут быть окрашены по Граму, но полученные из таких форм.
.

Окраска метенамином серебра по Грокотту

Для выявления элементов грибов в тканевых срезах.
Это основная окраска, которая должна быть использована при подозрении на грибковую инфекцию. Механизм: хромовая кислота реагирует с клеточной стенкной грибов, окисляя гликолевые группы полисахаридной цепи до альдегидных групп, котрые будут восстанавливать серебро из хлорида серебра с получением чёрных депозитов , т.е. реакция серебрения. Грибы окрашиваются в чёрный цвет.

.

Маллори

Этот метод особенно подходит для изучения соединительной ткани; срезы окрашиваются кислым фуксином, анилиновым синим, раствором оранжевого G и фосфомолибденовой кислотой;
коллагеновые волокна становятся синими, фибрин, нейроглия и миофибриллы - красными, эластические волокна - розовыми или жёлтыми.

Орсеин

Орсеин был впервые получен из лишайника, в настоящее время его получают из орцинола путем перекисного окисления в присутствии аммиака.
Это стандартный краситель, применяемый для демонстрации эластических волокон.
Он также применялся для окрашивания шероховатой эндоплазматической сети гепатоцитов, поражённых вирусом гепатита В (матово-стекловидные гепатоциты).

ШИК-реакция

Шифф-йодная кислота - метод окраски используемый в гистологии и патологии.
В основном этот способ применяется для определения гликогена в тканях. Йодная кислота селективно окисляет остатки глюкозы,
образует альдегиды, которые реагируют с реактивом Шиффа и создают красно-фиолетовый цвет.
Соответсвующий основной краситель часто используют как контрастное окрашивание.
.
Использование

ШИК-реакцию, в основном, используют для окрашивания структур, содержащих большой процент углеводных макромолекул (гликоген, гликопротеины, протеогликаны),
типично обнаруживаемых, например, в соединительной ткани, слизи и базальных пластинках.
ШИК-реакция позволяет дифференцировать различные типы болезней накопления гликогенов.
Однако, он имеет и другие преимущества, такие как распознавание некоторых форм рака, например, болезни Педжета или окрашивание макрофагов при болезни Уиппла.
Он также может быть использован для диагностики дефицита α1-антитрипсина, если перипортальные гепатоциты окрашиваются позитивно.
Наличие гликогена может быть подтверждено обработкой тканевых срезов диастазой для расщепления гликогена из среза,
с последующим сравнением срезов с- и без обработкой диастазой.
Диастазонегативный препарат будет показывать пурпурное окрашивание там, где гликоген присутсвует в тканевом срезе,
в то время, как препарат, который был обработан диастазой, будет показывать отсутствие какой-либо ШИК-позитивной реакции в тех же местах.
ШИК-реакция также используется для распознования эритролейкимии, лейкимии из незрелых красных кровяных клеток.
Эти клетки окрашиваются ярко фуксинофильно.
ШИК-реакция также используется для окрашивания целлюлозы.
Одним из примеров является поиск имплантированых медицинских приспособлений, состоящих из неокисленной целлюлозы.
.

Ван Гизон

Смесь кислого фуксина в насыщенном растворе пикриновой кислоты, используется для окрашивания коллагеновых волокон.
Он был введён в гистологию американским психоневрологом и патологом Ван Гизоном.

Окраска по Циль-Нильсену

Окраска по Циль-Нильсену, также известная как кислотоустойчивая окраска, впервые описана двумя немецкими врачами;
бактериологом Францем Цилем (1859 - 1926) и патологом Фридрихом Нильсеном (1854-1894).
Это специальная бактериологическая окраска, используемая для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, в основном, микобактерий.
ответсвенная за заболевание именуемое туберкулёзом, наряду с другими из этого рода.
Это помогает в диагностике Mycobacterium tuberculosis, поскольку её богатая липидами клеточная стенка делает её устойчивой к окраске по Граму.
Окраска также может быть использована для окрашивания немногих других бактерий, таких как Nocardia.
Реагенты, используемые при окраске по Циль-Нильсену - карболфуксин, кислый спирт и метиленовый синий.
Кислотоустойчивые бациллы будут ярко-красными после окрашивания.